1、用Nano LC-MS作蛋白质鉴定分析的优势?
2、用于蛋白质鉴定的凝胶样品需要在跑胶之前进行浓缩吗?
3、如何对样品进行浓缩?
4、我需要用什麽样的胶跑电泳?
5、我需要用什麽样的染色方法?
6、如何切割蛋白质胶带?
7、如何支付测试款?
8、凝胶带上最低需要多少蛋白质才能检测出来?
9、是否接受具有放射性活性的样品?

1. 用Nano LC-MS作蛋白质鉴定分析的优势?

主要有两个原因使Nano LC-MS鉴定蛋白质的技术比MALDI-TOF MS更为敏感、精确。第一，因为肽的总量和每个肽的两个连续片段都是已存在的，低量的甚 至只有一个消化肽的蛋白质都可以被鉴定。相反，以MALDI-TOF 为基础的蛋白质鉴定只能确定肽总量，因此它需要有大量的多肽的检测，才能达到较高的 蛋白质鉴定精度。第二，在以MALDI为基础的质谱分析的时候，只有很少百分比（一般1/ 1000至1/ 10000）的多肽分析物能被利用。这两个因素结合起来 使得LC - MS法比MALDI - TOF MS技术更加敏感、精确，虽然MALDI–TOF为基础的蛋白质鉴定的分析量比Nano LC-MS为基础蛋白质鉴定要高上数百倍。

在蛋白质鉴定中Nano LC-MS的另一个重要优势是它分析复杂混合物的能力。由于在MS和MS/MS之前样本中的肽被HPLC分离，因此，即使是蛋白质混合物中 一个微小的片段也可以被鉴定出来，前提是在整个液相分离的时候一个或多个肽没有被其他的肽完全隐藏。 与此相反，在MALDI-TOF分析的时候多肽混合 物没有被分解，所以它几乎不可能鉴定出蛋白质混合物中一个微小片段的蛋白质，甚至在MALDI – TOF为基础鉴定蛋白质的时候很难知道何时有些蛋白质 已经丢失了。样品制备采用SDS-PAGE而不是二维凝胶的时候，这样的问题变得很严重，因为在大多数微小规模蛋白质纯化过程中一个胶带中几种蛋白质的 协同泳动往往是经常发生的 。

2. 用于蛋白质鉴定的凝胶样品需要在跑胶之前进行浓缩吗?

这要看蛋白质样品浓度是否在100 fmole /μ左右，每个泳道装入10 μl大约相当于每个泳道有1pmol的蛋白质。 一个大于1 pmol的蛋白带可以通过各种染色方法显现出来（考马斯，锌，铜等），我们很容易鉴定出这种凝胶带。 然而，在通常情况下，由微量纯化程序准备的蛋白质样品体积要远远大于可 用于凝胶电泳的加载量。如果样品中蛋白质总量很低， 浓缩这个样品至可以装载到、1-3、（总计10-30μL）个凝胶泳道可能是增加显现胶带中蛋白质 和我们鉴定出蛋白质机会的最好方法。

3. 如何对样品进行浓缩?

传统蛋白质浓缩方法如膜层析、TCA沉淀和过滤膜蛋白往往并不适用于微观纯化过程，由于样品损失比例很大。 干燥下的蛋白样品会导致高浓度的盐的产生，可能会有其他化学物质干扰凝胶电泳。根据我们的经验， 我们提出一个简单而快速的方法，蛋白质被固定在装有一些反相颗粒的微柱，洗脱除去盐， 并在凝胶加样前用 SDS缓冲液洗脱（沸腾或不沸腾）。我们一直在利用来自Stradegene的GeneClean和R1/R2 的应用系统以及每个能得到好的样品回收的 方法。然而，由于每个蛋白质都有其独特的特性和不同的纯化程序， 可能导致不同的样本，研究人员正在努力确定和优化他们的最好的样本浓缩程序。 原则上，浓缩样品的方法将不会对以后凝胶分离蛋白的质谱鉴定步骤造成影响。所以， 一个样品浓缩方法的有效性可以很容易的用样品回收率和样品在 凝胶电泳中的状态来进行判断， 可以通过运行一个加载了等量的未浓缩样品和浓缩样品的凝胶电泳来监测。

4. 我需要用什麽样的胶跑电泳?

很多种聚丙烯酰胺凝胶与MS分析兼容，包括传统的Tris-Glycine凝胶，或市面上许多品牌的预制凝胶如 Novax NuPAGE Bis-Tris，Tris-Acetate凝胶。在蛋白质鉴定中，我们还没有观察到不同比例的一个凝胶或梯度凝胶， 或不同厚度的一个凝胶导致的显著影响。尽管如此，根据我们的经验我们还是建议 不要使用Tricine凝胶 进行蛋白质鉴定。

5. 我需要用什麽样的染色方法?

凝胶可以用许多不同的染色方法染色，包括考马斯蓝染色，胶体考马斯染色，铜染色，锌染色，荧光染料染色和银染色。 传统的银染不兼容质谱分析， 但一些修改的银染色程序，消除了以感光剂为主的glutaldehyde的使用，被认为更兼容 MS分析。有几种商业银染色包声称与MS兼容。但是根据我们的经 验，等量的蛋白质，胶回收时使用所谓与 MS兼容的银染染色的胶带中肽的产量还是要比用胶体考马斯染色的胶带的产量低。虽然我们接受银染凝胶样品， 我们还是建议我们的客户尽量使用胶体考马斯染色，铜染色，锌染色方法以纯化足够的蛋白质样品（检测最低限量为 ng），而且使用银染时想要提纯更 多的蛋白质太难了。从长远来看，优化纯化过程的收益往往是很大的， 可以大大提高鉴定的成功率，得到一个高可信度的蛋白质鉴定结果，而且这些经 验对以后的工作也很重要。
此外，请小心以避免在此步骤中样品被污染。直接用手接触、使用脏的容器或者被污染了的试剂都将可能导致鉴定的失败！

6. 如何切割蛋白质胶带?

从凝胶中切割出蛋白条带时千万要十分小心！第一，采取一切预防措施，以避免用手或任何有可能被污染的表面直接接触到凝胶体， 如灯箱、刀片或使用过的容器。您需要戴上干净的手套，将胶体放置在灯箱下的干净塑料薄膜上（如Sara Wrap ），并使用干净的刀片和凝胶容器。请记住，即使是极小块 的人体皮肤也可能含有比凝胶带上蛋白质量高出数百倍的角蛋白。 第二，切出来的凝胶切片的大小应接近该蛋白带的大小。太小的凝胶切片意味着宝贵 的样品的损失，而过大的凝胶切片可能会降低 酶切的消化效率和肽的回收率。蛋白带被切下来之后，小心转移到一个干净的500μl离心管中。盖上盖， 贴上标签： 用石蜡膜包裹，以防止凝胶片干燥（你也可以添加〜10微升1％醋酸/水，以防止其干燥）。如果你需要切割出若干个蛋白带， 一个一个的 做，以免这些蛋白带混淆。每个错误将很难再追查。

7. 如何支付测试款?

付款方式: 为了尽可能地缩短客户的等待分析结果的时间，我们在收到样品后即开始分析测试。客户应在我们完成测试之前进行测试费转帐， 并将转底单电传至0512-62956172。我们在接到转帐底单并核实后将测试报告送给用户。
请将测试费转入以下账户：
账户名称：苏州普泰生物技术有限公司
开户行：建行苏州工业园区支行
账号：32201988836051515006

8. 凝胶带上最低需要多少蛋白质才能检测出来?

由于我们使用了Nano-LC-MS技术用于蛋白质的鉴定，我们将有很大的机率可以鉴定出一个非常微弱的考马斯染色带。 我们不能保证100％的成功，因为一个含量微弱的条带有可能实际上只是一个错觉，而不是一个真正的蛋白带。不过， 我们可以对所有考马斯染色的样品保证质量（如果鉴定失败将免费）， 即使这个条带是个错觉。

Nano-LC-MS/MS技术的另一个优势是它能够鉴别一个复杂混合物中的蛋白质。我们鉴定出在一个单一的凝胶带中超过 5种蛋白质或在一个溶液样品中超过30种蛋白质的情况并不罕见。

9. 是否接受具有放射性活性的样品?

常感谢您对我们的生物分析服务的兴趣。 然而，由于我们没有放射性材料的工作许可证，我们不能接受您的样品